灌流培养工艺类器官免疫共培养实验方法

浪子回头二瞅

　　近年来，灌流培养工艺肿瘤免疫疗法在癌症治疗中非常火热。肿瘤免疫学治疗的目的是激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。随着免疫治疗的兴起也推动了肿瘤研究的发展，但是由于人源化体系的复杂性、免疫系统的部分或无效重组建等问题，致使免疫肿瘤模型面临着巨大的挑战，临床上迫切需要能够用于个体化验证疗效的体外模型。类器官的出现给肿瘤免疫治疗提供了新的契机，然而，现有的类器官中缺乏免疫细胞限制了其发展。
　　小爱这次给大家介绍一下基本的肿瘤类器官免疫共培养方法，如下：
　　1、类器官准备
　　1）提前一周，复苏培养类器官至状态良好；
　　2）取合适数量类器官，使用预冷PBS清洗数次，去除大部分基质胶；
　　3）使用培养基重悬类器官。
　　2、PBMC分离和类器官共培养
　　1）外周血在无菌环境下，使用添加EDTA-K2的真空采血管采集，运输保存；
　　2）将新鲜静脉血与PBS缓冲液1：1稀释，轻轻混匀待用；
　　3）添加4ml细胞分离液（abs930），缓慢加入静脉血混合物8ml，静置待用；
　　4）2000rpm离心20min，在此过程中升降速度降至1，避免产生细胞融合；
　　5）此时观察到15ml离心管为4层，轻轻吸取第2层白色悬浮物于15ml离心管，混匀待用；
　　6）1500rpm离心10min，在此过程中升降速度降至1，避免产生细胞融合，弃上清；
　　7）添加适量T细胞无血清基础培养基静置培养观察。T细胞无血清完全培养基的配置：向T细胞无血清基础培养基里添加IL-2（abs05543）200-500单位/ml（刺激T细胞生长与增殖），CD3/CD28磁珠（abs160019）3ug/ml（激活T细胞）；
　　8）使用T细胞无血清完全培养基，悬浮调整至合适浓度，96孔板，每孔约加入5*105 活T细胞，100ul体积；
　　9）重悬类器官混合液，分别加入等量的样至96孔板中，至总体积200ul。
　　3、培养观察
　　1）D0观察记录类器官和T细胞状态；
　　2）37℃，5% CO2条件下培养，每日连续观察；
　　3）D3吸出100ul培养上清，加入100ul新培养基，同时加入（处理抗体或药物）使至终浓度100nM（如果D3已出现显著差别，则记录大视野明场形态，终止实验）；
　　4）观察至实验组间差异显著，拍照记录大视野细胞明场形态；
　　5）细胞上清保存用于后续检测。